Karcinogenéza sa študuje pomocou rôznych štandardizovaných toxikologických testov. Prvá časť týchto testov sa vykonáva in vitro a - ak sú pozitívne - pristúpime k experimentu in vivo. Tento experimentálny prístup krok za krokom sa nazýva ROZHODOVACÍ BOD PRÍSTUP, postupnosť pokusov, ktoré sa zastavia na konci každého pokusu, aby sa rozhodlo, ako v procese pokračovať. Existuje päť fáz:
FÁZA A: štruktúra a vlastnosti karcinogénnej zlúčeniny;
FÁZE: v tejto fáze krátkodobého testovania in vitro sa používajú bunky cicavcov. Najbežnejšie používanými bunkami sú hepatocyty, pretože sa študuje rozsah opravy poškodenia, ktoré hepatocyt vyvíja podľa závažnosti poškodenia spôsobeného látkou. Stručne povedané, neurčujeme poškodenie samo o sebe, ale to, koľko z opravného systému aktivovala pečeňová bunka.
Implementovaným postupom je vytvorenie 3 kultúr hepatocytov. V prvej kultúre sú hepatocyty zdravé, v druhej sú ošetrené testovanou látkou a nakoniec v tretej sú ošetrené kontrolnou látkou, ktorá je určite karcinogénna.Tieto tri kultúry obsahujú rádioaktívnu pyrimidínovú bázu, ktorou je tritiovaný tymidín, ktorý funguje ako marker.
Ak skúmaná zlúčenina spôsobuje mutáciu v DNA, bunka na tento problém reaguje aktiváciou opravných systémov. Kus DNA, ktorý prešiel mutáciou, sa odreže a vďaka pôsobeniu DNApolymerázy sa chýbajúci kúsok nahradí novým. Na korekciu DNApolymeráza použije nové bázy vrátane tritiovaného tymidínu. Začlení sa rádioaktívna báza. Analýza rádioaktivity určuje úroveň mutácie v ošetrených bunkách: čím vyššia je rádioaktivita, tým väčšie sú mutácie DNA.
Tiež vo fáze B sa vykonávajú testy na baktériách, aby sa dalo študovať, či existujú nejaké reverzné mutácie. Použité baktérie sú salmonely, ktoré sú už nosičmi mutácií. Mutácia sa týka syntézy histidínu, takže salmonely nie sú schopné rásť bez histidínu. Tieto bakteriálne kolónie sa čiastočne ošetria testovanou látkou, čiastočne na negatívnu kontrolu a čiastočne na pozitívnu kontrolu a potom sa testujú so známym karcinogénom. Ak je táto testovaná látka nepriama genotoxická, musia sa do kultivačného média zaviesť metabolizujúce enzýmy. V tomto mieste sú 3 kultúry, ktoré budú naočkované a pestované v Petriho miskách (v kultivačnom médiu nie je žiadny histidín). Ak v testovanom karcinogéne nenastali žiadne mutácie, teoreticky by na miskách nemala byť žiadna. „Ak došlo k mutagénnemu účinku karcinogénu, môže to zmeniť prvú mutáciu a vytvoriť druhú mutáciu schopnú pestovať baktérie na kultivačnom médiu bez histidínu. V tomto prípade druhá mutácia, ktorá modifikuje prvú mutáciu a má názov RETROMUTÁCIA Nakoniec, ak dôjde k výraznému nárastu v piasta petri, je karcinogén priamy.
Vždy pomocou testu in vitro je možné stanoviť chromozomálnu integritu. Tento test sa vždy vykonáva na bunkách cicavcov a používa sa na testovanie toxických látok, ktoré môžu spôsobiť mutácie niektorých enzýmov zodpovedných za biosyntézu DNA. Látka, ktorá sa má testovať podrobí sa analýze in vitro Aby sa určilo, či skúmaná látka ovplyvňuje integritu a počet prítomných chromozómov, používa sa mikronukleový test. Mikrojadrá sú vezikuly, ktoré sú tvorené časťou chromatínu vo vnútri. Chromatínom začleneným do týchto mikrojadier môžu byť buď celé chromozómy alebo fragmenty chromozómov. Mikrojadrá sú tvorené nesprávnym delením buniek, čo vedie k vzniku dcérskych buniek s genetickým materiálom, ktorý nie je rovnaký distribuované. Výsledkom tohto testu bude stanovenie látok, ktoré sú definované klastogénnymi a vretenovými jedmi. Klastogénna látka produkuje mikrojadrá s acentrickými fragmentmi chromozómov, takže látka vyvoláva zlom v chromozómoch, namiesto toho jedovatá látka vretena produkuje mikrojadrá, v ktorých sa nachádzajú celé chromozómy.
Ak skúmaná látka vyvoláva genotoxicitu v jednom alebo viacerých testoch, je to definované ako veľmi podozrivé, takže ide priamo do fázy D. Ak na druhej strane testovaná látka nevyvoláva žiadny genotoxický účinok, prechádza do fázy štúdie. C, pretože to môže byť promótor.
FASEC: v tejto fáze je možné vykonať testy in vitro aj in vivo.
Pri testoch in vitro bolo možné demonštrovať možnosť promótorovej látky prelomiť medzery medzi normálnymi bunkami a nádorovými bunkami, s následným prechodom látok medzi tieto dve bunky.
In vivo test je indukcia kožných nádorov u myší. Látka, ktorá sa má testovať, sa dvakrát až trikrát týždenne aplikuje na kožu myši. Do 2/3 mesiacov, ak je táto látka promótorom, môžu existovať papilómové formácie. U myší sa zvažujú dva hlavné údaje: počet myší postihnutých papilómami a počet papilómov prítomných na každom zvierati. Ak látka funguje ako promótor a u ošetrenej myši sa vyvinie nádor, znamená to, že ide skutočne o látku s promótorovým účinkom.
Akonáhle sú tieto testy dokončené, prejdeme k dlhodobým testom in vivo.
FASED: v tejto fáze sa testujú všetky zlúčeniny, ktoré sú mutagénne, a všetky zlúčeniny, ktoré nepreukazujú mutagénnosť. Testy, ktoré je možné vykonať, sú rôzne. Niektoré z nich sú testy na pečeni, pľúcach a nakoniec na prsníku.
Pečeňový test demonštruje tvorbu nie novo vytvoreného nádoru, ale neoplastického zamerania, teda niečo, čo sa pripravuje na to, aby sa stal nádorom. Bunky tohto zamerania sú už atypickými bunkami, preto prešli mutáciou a pripravujú sa na to, aby sa stali neoplastickými bunkami. Po určitom čase sa vďaka pitevnému vyšetreniu určí tvorba prednádorových ohnísk vypočítaním počtu a rozsahu týchto prednádorových útvarov.
Pľúcny test umožňuje stanovenie adenómu, ktorý je "anomáliou buniek pľúcneho tkaniva. Aj v tomto prípade sa pľúcne tkanivo potkana vyšetruje po pomerne dlhom čase (mesiacoch) (tieto adenómy sú ľahko identifikovateľné, pretože sú belavé uzlíky na pľúcnom epiteli).
Test prsníka umožňuje stanovenie nádorov v tkanive žľazy. Vždy sa hodnotí počet vytvorených adenómov a počet zvierat vykazujúcich adenómy.
Ak existujú pozitívne výsledky týchto testov, testovaná látka je skutočne karcinogénna. V tomto mieste prechádzame na vykonávanie nákladných testov s veľmi dlhými časmi vykonávania.
FÁZA: v tejto fáze je dlhodobým testom podrobený rôzny počet zvierat od 20 do 50. Tieto testy sú veľmi nákladné a dlho trvá, kým sa dosiahnu určité výsledky; hovoríme o 1/8 života zvieraťa.Je možné, že počas procesu týchto testov niektoré zvieratá uhynú, ale vždy sú študované pitvou a histologickým typovým vyšetrením. Vybrané zvieratá sú vždy potkany a myši a iba 70-80% prežije až do konca dlhodobých testov. Použité zvieratá sú práve odstavené, pretože čím sú mladšie, tým sú citlivejšie na liečbu. Počas dlhodobého testovacieho obdobia je výskumný pracovník vždy podporovaný matematikom-štatistikom, ktorý je schopný vziať do úvahy všetky zhromaždené informácie a reprodukovať rôzne údaje.
Dávky testované na zvieratách začínajú od maximálnej tolerovanej dávky a všetkých jej čiastkových násobkov a hodnotí sa reakcia odozvy na dávku u zvieraťa.
Podávanie sa musí vždy blížiť ceste, ktorou môže muž prísť do kontaktu s vyšetrovanou látkou, teda orálnou, kožnou alebo respiračnou cestou, pričom ak sa testuje karcinogenita liečiva, je tiež užitočné vykonať intravenózne podanie.
Testované skupiny zvierat sú 4 (50 zvierat pre každú skupinu):
- Skupina NAIF, ktorá nemá liečbu;
- Skupina ošetrená vehikulom;
- Skupina ošetrená testovanou látkou;
- Skupina liečená známym karcinogénom.
Je veľmi dôležité, aby bol počet zvierat v každej skupine čo najrovnejší. V skutočnosti, ak je v počte zvierat príliš veľký rozdiel, štatistický test sa môže ukázať ako falošný.
Vykonané hodnotenia sú tieto:
- Celková frekvencia nádorov;
- Frekvencia niektorých nádorov;
- Frekvencia zvierat s viac ako jedným typom nádoru;
- Počet rakovín zvierat.
Na konci všetkých týchto fáz štúdie je látka klasifikovaná v rebríčku, ktorý stanovila IARC (Medzinárodná agentúra pre výskum a vývoj rakoviny) a Agentúra na ochranu životného prostredia (EPA).
Ďalšie články o "Štúdii a hodnotení karcinogenézy"
- Karcinogenéza
- Toxicita a toxikológia
- Toxikológia a teratogenéza reprodukčného cyklu